Auf dem humanistischen Wöhlergymnasium machte ich meine erste Theaterinszenierung in lateinischer Sprache. Durch den häufigen Schulwechsel brachte ich es aber nicht weit und verließ vor der Mittleren Reife die Schule, wechselte zur Kunstschule Offenbach für ein Jahr.
Dann wurde ich auf der Hochschule für bildende Künstle in die Abteilung Freie Malerei aufgenommen. Hier studierte ich Anfang der sechziger Jahre, ging aber vor einem Abschluss ab.
1967 entstanden mein erstes Buch und auch mein erster Kurzfilm Von Rosa von Praunheim. Durch den Verkauf des Films an den Hessischen Rundfunk konnte ich weitere Filme produzieren. 1968 bekam ich für meinen zweiten Kurzfilm Rosa Arbeiter auf goldener Straße Preise und wurde schnell bekannt.
1970 drehte ich drei größere Filme, darunter Die Bettwurst, die bis heute ein Kultfilm ist und Nicht der Homosexuelle ist pervers, sondern die Situation in der er lebt, mit dem ich die neue deutsche Schwulenbewegung gründete. Durch den Skandal, den dieser Film auslöste, wurde ich berühmt und berüchtigt.
Bis heute habe ich über 150 Filme gedreht.
Neben dem Thema Homosexualität habe ich Filme in und über New York gemacht (Überleben in New York) und Filme mit älteren vitalen Frauen (Evelyn Künneke und Lotti Huber). Ich habe einige Filme über Aids gemacht und mich persönlich in der Aids Krise fast 10 Jahre für Prävention engagiert. Mein Outing von schwulen Prominenten war ein Verzweiflungsschrei auf dem Höhepunkt der Aidskrise.
1992 verfilmte ich das Leben des Transvestiten Charlotte von Mahlsdorf Ich bin meine eigene Frau. Die meisten meiner Filme sind auf vielen internationalen Festivals gelaufen.
Im Herbst 1999 habe ich einen meiner schönsten Filme in einem Dorf in Mecklenburg-Vorpommern gedreht, Wunderbares Wrodow. Er bekam den Robert Geisendörfer Medienpreis. Meine letzten Filme sind Der Einstein des Sex, der im März 2000 im Ventura Verleih, in die Kinos kam und Can I Be Your Bratwurst, Please? mit Jeff Stryker, den ich im Winter ‘98 in Hollywood drehte und der bis jetzt auf über 250 internationalen Festivals lief. Im Frühjahr 2000 drehte ich für ZDF und ARTE die lange Dokumentation Für mich gab es nur noch Fassbinder – die glücklichen Opfer des Rainer Werner F. die im Winter 2000 ins Fernsehen kam. Im Februar 2002 wurde bei den den Berliner Filmfestspielen im Panorama meine Doku Tunten lügen nicht mit den Berliner Tunten Ovo Maltine, Tima der Göttlichen, Bev Stroganoff und Ichgola Androgyn uraufgeführt und ist seitdem auf vielen internationalen Festivals zu sehen. Mein Spielfilm Kühe vom Nebel geschwängert mit dem Obdachlosentheater Die Ratten wurde im September 2002 auf den Filmfestspielen in Venedig gezeigt, später auf den Festivals in Hof und Rotterdam und bekam eine kleine Kinoauswertung. Zu meinem 60. Geburtstag am 25. November 2002 drehte ich zusammen mit dem Kameramann Rene Krumenacher einen autobiographischen Film, mit dem Titel Pfui Rosa. Im Herbst 2003 stellte ich die Dokumentation Ratten 07 für das ZDF/ARTE her.
Bei den Berliner Filmfestspielen 2005 durfte ich drei neue Filme zeigen. Wer ist Helene Schwarz – eine lange Dokumentation über die Muse des deutschen Films, die 36 Jahre an dem deutschen Film und Fernsehakademie in Berlin Studenten betreut und heute immer noch im Alter von 78 Jahren dort arbeitet. Ein liebevolles Portrait einer wunderbaren Frau und eine Geschichte des deutschen Films mit vielen berühmten Regisseuren. Männer Helden und schwule Nazis – eine lange Dokumentation über schwule Männer und ihrem Interesse an rechtsradikales Gedankengut.
2006 drehte ich Mit Olga auf der Wolga eine Doku über eine Flusskreuzfahrt von Moskau nach Sankt Petersburg mit einer Gruppe von originellen Berlinern. Der Spielfilm Sechs tote Studenten ist eine Komödie über meine Zeit als Filmprofessor.
Im Jahre 2000 offenbarte mir meine damals 94-jährigen Mutter, dass ich nicht ihr Sohn bin. Sie hatte mich in Riga während der deutschen Besatzung in einem Kinderheim gefunden. Mehr sagte sie nicht. Im Jahr 2003 verstarb sie. Zuerst wollte ich nicht nach meiner leiblichen Mutter forschen, da ich eine liebevolle hatte. Erst später erwachte meine Neugier. Doch ohne meinen richtigen Familiennamen schien die Suche zwecklos. Durch einen lettischen Journalisten fand ich Agnese, die im Staatlichen Archiv Lettlands Erstaunliches herausfand. Ebenso erstaunlich war es, dass ich in Berlin tatsächlich meine richtige Geburtsurkunde fand. Darin stand, dass ich 1942 im Zentralgefängnis in Riga zur Welt gekommen war. Ich dokumentierte die Suche in dem Film Meine Mütter, der auf den Hofer Filmtagen im Oktober 2007 seine Premiere hatte.
Anfang 2008 beendete ich den Film Tote Schwule – lebende Lesben. Ich portraitiere drei Zeitzeugen der Nazizeit, Walter Schwarze, Joe Luga und Albrecht Becker, die alle inzwischen verstorben sind und fünf starke lesbische Frauen von heute.
In Hof zeigte ich im Herbst 2008 meinen Kurzfilm Rosa Riese, einen Film über einen Massenmörder aus Brandenburg. Das Festival verlieh mir den Filmpreis der Stadt Hof, eine ganz besondere Auszeichnung für mich, da ich seit über 20 Jahren eng mit dem Festival verbunden bin, dort 14 Filme zeigen durfte.
2009 drehte ich den Film Rosas Höllenfahrt, einen Dokumentarfilm, in dem ich mich auf die historischen Spuren der Höllenvorstellungen verschiedener Religionen und Kulturen begebe.
Eine Retrospektive in New York entfachte meine Liebe zu der Metropole neu. Ich wollte unbedingt wieder einen New-York-Film drehen. Ich traf viele Protagonisten meiner früheren Filme wieder und so entstand die Idee zu der Dokumentation New York Memories, die Fortsetzung meines Kinoerfolges Überleben in New York.
2011 hatte mein Film Die Jungs vom Bahnhof Zoo uf der Berlinale Premiere, ein Film über männliche Prostitution in Berlin.
In seinem autobiografischen Film Praunheim Memoires (2014), unter anderem mit Sonya Kraus, geht von Praunheim auf Suche nach Stationen seiner Jugend im Frankfurter Stadtteil Praunheim. Die Dokumentation eröffnete 2014 das Lichter Filmfest Frankfurt International. Als Hommage der Stadt Frankfurt am Main an den Regisseur, der seine Jugendzeit in der Mainmetropole verbrachte und den Frankfurter Stadtteil Praunheim in seinem Künstlernamen trägt, zeigte das Festival im selben Jahr von Praunheims Filme Unsere Leichen leben noch und Meine Mütter.

Von Praunheims Missbrauchsdrama Härte über den einst skrupellosen Berliner Zuhälter Andreas Marquardt, der als Kind massive sexuelle Übergriffe erlebte, hatte 2015 bei der Berlinale Uraufführung und eröffnete die Festivalsektion Panorama. Beim Panorama Publikumspreis platzierte sich Härte unter den beliebtesten Filmen. Hanno Koffler wurde für die schauspielerische Verkörperung Marquardts als bester männlicher Hauptdarsteller für den Deutschen Filmpreis nominiert. Luise Heyer spielte die weibliche Hauptrolle, Marquardts Lebensgefährtin. Härte wurde unter anderem beim Zinebi-Festival in Bilbao, bei den Deutschen Filmtagen in Bukarest, den Internationalen Filmfestspielen von Helsinki und Vancouver sowie beim Mix Brasil Festival in São Paulo, dem größten queeren Kulturfestival Südamerikas, gezeigt. Der Film fand auch im asiatischen Raum viel Beachtung und wurde zum Beispiel in Kyōto, Tokyo, beim Hong Kong International Film Festival und Chennai International Film Festival aufgeführt.

In von Praunheims Dokumentarfilm Überleben in Neukölln (2017) stehen Neuköllner Künstler wie die Dragqueen Juwelia Soraya im Mittelpunkt der Handlung. Der Film feierte 2017 seine Premiere beim Filmfest München und wurde unter anderem im selben Jahr beim Kunstfestival 48 Stunden Neukölln gezeigt. Die Dokumentation wurde beim Merlinka Filmfestival (2018) in Sarajevo, Belgrad und Podgorica für den Jury-Preis nominiert. Bereits 2012 und 2013 hatten sich Filme des Regisseurs für die Jury Preis-Nominierung qualifiziert. Von Praunheims Krimidrama Darkroom – Tödliche Tropfen wurde erstmals 2019 beim größten queeren Filmfestival Spaniens FIRE!! in Barcelona gezeigt und im selben Jahr beim Filmfest Hamburg für den Art Cinema Award nominiert. 2020 eröffnete der Film den Max Ophüls Preis in Saarbrücken. Das tip Magazin wählte Darkroom – Tödliche Tropfen unter die wichtigsten Filme des Jahres 2020. Mit seiner Dokumentation Operndiven, Operntunten (2020), zum Beispiel mit Edda Moser, Sophie Koch, Dagmar Manzel und Barrie Kosky, machte von Praunheim die Oper als einen traditionellen Treffpunkt schwuler Männer bekannt. In der bislang unveröffentlichten Langfassung des Films kommen zum Beispiel auch Rufus Wainwright und dessen Lebensgefährte, der Kunstkurator Jörn Weisbrodt, zu Wort.

Von Praunheim besetzt seine Spielszenen oft und bewusst mit Laiendarstellern, arbeitete aber auch mit Schauspielgrößen wie zum Beispiel Otto Sander, Wolfgang Völz, Charly Hübner, den Geschwistern Ben und Meret Becker, Eddie Constantine als auch mit Katy Karrenbauer, die für ihre Rolle in von Praunheims Film Härte mit einem Sonderpreis der Deutschen Filmakademie geehrt wurde.

Von Praunheim kooperierte auch mit Schulen, um Schülern Filmaufführungen mit anschließenden Gesprächen anzubieten, unter anderem an der queeren Harvey Milk High School in New York City, an der Harvey Milk Civil Rights Academy in San Francisco, aber zum Beispiel auch in Zusammenarbeit mit der Akademie der Künste in der Filmfabrik Wolfen für Schüler aus Bitterfeld-Wolfen und Umgebung. Ebenso leitete er Workshops für Schüler zu kulturellen Themen, unter anderem im Berliner Martin-Gropius-Bau in Kooperation mit der Bildungs- und Kulturvermittlungsinitiative Ephra.

Am 5. September 2008 drehte von Praunheim das Segment über die Darkroombar Ficken 3000 für Volker Heises 24-stündiges Dokumentarfilmprojekt 24h Berlin – Ein Tag im Leben, das genau ein Jahr später auf mehreren Fernsehsendern ausgestrahlt und mit dem Bayerischen Fernsehpreis ausgezeichnet wurde. Ebenfalls war von Praunheim mit der Episode Knast und Kinder an dem RBB-Dokumentarfilmprojekt 20 x Brandenburg beteiligt, das 2011 mit dem Grimme-Preis ausgezeichnet wurde. In der RBB-Hauptstadtchronik Schicksalsjahre einer Stadt (2018) wirkte er als Protagonist mit.

Seit 2009 ist von Praunheim Mitglied der Akademie der Künste, Sektion Film- und Medienkunst, der er von Mai 2015 bis Mai 2018 als Direktor vorstand. Ebenso ist er Mitglied der Deutschen Filmakademie und der Europäischen Filmakademie.

Auszüge aus von Praunheims Werk waren Teil der Homosexualität_en-Ausstellung (2015) im Deutschen Historischen Museum.

Die Berliner Akademie der Künste ehrte 2018 Rosa von Praunheim – zusammen mit Elfi Mikesch und Werner Schroeter – mit der dreimonatigen Ausstellung Abfallprodukte der Liebe, eine Hommage der Akademie an die drei befreundeten Regisseure. Daran anschließend wurden die Werke in Amsterdam ausgestellt.

Anlässlich des achtzigsten Geburtstages von Elfi Mikesch im Jahr 2020 brachte von Praunheim das Foto-Buch vis-à-vis über seine langjährige Weggefährtin heraus. Bereits 1969 brachten er und Mikesch einen gemeinsamen Foto-Roman unter dem Titel Oh Muvie heraus.

Von Praunheim hielt die vom Deutschen Literaturinstitut ausgerichtete Poetikvorlesung beim Literaturfestival Leipziger literarischer Herbst (2021) im Paulinum der Universität Leipzig.

Als Laudator bzw. Juror vergab er unter anderem den Friedensfilmpreis (2013), den MFG-STAR (2015) und 2019 den Europäischen Filmpreis an Agnieszka Holland.

Von Praunheim nahm an zahlreichen Podiumsdiskussionen teil, zum Beispiel 1981 an den Frankfurter Römerberggesprächen mit Marcel Reich-Ranicki, 2010 am Jean-Genet-Symposium in der Freien Universität Berlin, 2014 in der Bundesstiftung Aufarbeitung in Berlin, in der eine Veranstaltung zu Ehren von Valentīna Freimane stattfand, über die er 2012 den Kurzfilm Valentina gedreht hat, sowie 2018 im Berliner KW Institute for Contemporary Art anlässlich einer Veranstaltung für den verstorbenen Kunstkurator Frank Wagner.

Im Rahmen seiner journalistischen Tätigkeit schrieb er auch Beiträge für Zeitungen und Magazine, zum Beispiel für den Spiegel.

Gelegentlich tritt der Regisseur in Gastrollen als Schauspieler in Erscheinung, unter anderem in Anthony Manns Todestanz eines Killers, Ulrike Ottingers Die Betörung der blauen Matrosen, Marianne Enzensbergers Der Biß und Axel Ranischs Ich fühl mich Disco. Außerdem war er in einer Vielzahl von Talkshows und Fernsehsendungen zu Gast.

Von Praunheim malt seit seiner frühen Jugend. Seit den 2010er Jahren konzentriert er sich vor allem auf Zeichnungen und Malereien im Pop-Art-Stil und stellt gelegentlich in Galerien und Museen aus, zum Beispiel im Berliner Haus am Lützowplatz (2012/2013), im Frankfurter Kunstkabinett Hanna Bekker vom Rath (2014), in der Galerie Raab (2016), eine der führenden Adressen in Berlin für die figürlich betonte Malerei, und als Teilnehmer der Gruppenausstellungen Voice = Survival – A visual AIDS exhibition (2017) in der New Yorker Galerie The 8th Floor sowie United by AIDS – Eine Ausstellung über Verlust, Erinnerung, Aktivismus und Kunst als Reaktion auf HIV/AIDS (2019) im Zürcher Migros Museum für Gegenwartskunst.

Er kuratierte auch Ausstellungen und Begleitprogramme, unter anderem in der Akademie der Künste, in der New Yorker School of Visual Arts und im Lincoln Center für darstellende Künste, ebenfalls in New York City.